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mRNA差异显示技术 发布于:

mRNA差异显示技术(mRNA differential display PCR, mRNA DD-PCR),是由Peng Liang等人在1992年建立的筛选基因差异表达的有效方法。它是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。每一种组织细胞(包括同一组织细胞经过不同的处理)都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因谱,即特异的RNA指纹图谱。

差异基因表达是细胞分化的基础。正是这些基因在细胞中的特异表达与否,决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期的调节、细胞衰老和死亡等。mRNA DD-PCR技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。不同的组织/细胞或遗传背景相同的同一组织/细胞经过不同的处理后,提取各自的总RNA,进行mRNA的逆转录合成 cDNA。进行逆转录时3'端引物采用oligo(dT)l2MN,其中M为A、C、G中的任何一种,N为A、C、G或T中的任何一种,所以共有12种oligo(dT)l2MN引物。其申M称为锚定引物,起增大引物Tm值的作用。N称为分类碱基,对逆转录进行归类。

用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成,即进行12次不同的逆转录反应,从而使逆转录的cDNA具有12种类型,也就是对cDNA进行12种归类(较为流行的是进行4种归类,即3'端引物采用oligo(dT)12M, M为A、C、G中的任何一种)。5'端引物采用20条由10个碱基组成的随机引物。对每一类cDNA进行随机引物和逆转录引物PCR扩增,通过对不同的组织/细胞或经不同处理的同一组织 /细胞的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物的凝胶电泳分析,从而反映出不同样品的基因在时间和空间上的组织特异性表达。简述其基本原理,就是将基因背景相同的2个或几个细胞系或组织mRNA逆转录成cDNA,用不同引物对,进行PCR扩增,扩增时加入同位素标记的核苷酸。用测序胶电泳分离PCR产物,经放射自显影即可找到被扩增的差异表达的基因。

组织样品总RNA的提取→去除RNA样品中的微量DNA→设计引物序列→逆转录归类反应体系的建立→PCR选择性扩增→mRNA DD-PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳→差异表达条带的回收→回收条带的再次扩增→二次扩增产物的克隆、测序和GenBank查询→Northern Blot和 Dot Blot杂交。

通常情况下,在某一细胞中或某一个关键的发育时间点上有15000种以上的基因在表达。如此众多种类的mRNA逆转录产物经PCR选择性扩增后其类型依然众多,很难用电泳系统加以快速准确地分离。因而需要对逆转录产物的cDNA进行归类处理,减轻不同PCR产物电泳分离的难度,提高分离的准确率。该方法就具有快速、灵敏和重复性好等优点。

mRNA DD-PCR技术是筛选和克隆差异表达基因的一种快速而行之有效的方法。


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